南京惠言達電氣有限公司成立于2019年，座落在南京六合市商圈。9年備件銷(xiāo)售積累，公司主要經(jīng)營(yíng)歐、美等國的閥門(mén)、過(guò)濾設備、編碼器、傳感器、儀器儀表、及各種自動(dòng)化產(chǎn)品，公司全力貫徹“以質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的產(chǎn)品和完善到位的技術(shù)服務(wù)客戶(hù)”的經(jīng)營(yíng)宗旨，服務(wù)于國內的流體控制和自動(dòng)化控制領(lǐng)域。節省了中間環(huán)節的流轉費用，能夠把更優(yōu)惠的價(jià)格提供給用戶(hù)。通過(guò)發(fā)展我司已經(jīng)自動(dòng)化設備和備件供應商，主營(yíng)產(chǎn)品廣泛應用于冶金、造紙、礦山、石化、能源、集裝箱碼頭、汽車(chē)、水利、市政工程及環(huán)保以及各類(lèi)軍事、航空航天、科研等領(lǐng)域。
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Preeflow計量閥ECO-PEN700日益見(jiàn)長(cháng)

Preeflow計量閥ECO-PEN700日益見(jiàn)長(cháng)

實(shí)驗動(dòng)物：斷奶后（2~6個(gè)月）的關(guān)中奶山羊，均由西北農林科技大學(xué)提供。主要試劑：胎牛血清、分離液、胰蛋白酶、EDTA、地塞米松、β-甘油磷酸鈉等試劑盒以及抗體均購于武漢博士德公司，其他試劑為國產(chǎn)分析提純。

1．2實(shí)驗方法

1．2.1動(dòng)物模型選取選用斷奶后的關(guān)中奶山羊12只，雌雄不限，采用隨機區組設計的方法將實(shí)驗動(dòng)物分成2組。1．2.2原代BMSCs的提取與培養選取斷奶的關(guān)中奶山羊，骨髓的抽取和MSCs的分離、培養按照馬勇江的方法進(jìn)行。

1．2.3細胞鑒定取培養第2代細胞，先用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用PBS（磷酸鹽緩沖液）調整細胞濃度1×107個(gè)/ml，細胞鑒定采用CD34-FITC、CD90-PE、CD14-perCP、CD54-APC對細胞標記，置4℃避光孵育30min以上，采用PBS洗1次，應用流式細胞儀進(jìn)行表面抗原檢測。

1．2.4細胞誘導取第2代細胞移入HG-DMEM液進(jìn)行培養誘導。

1．2.5礦化誘導鑒定采用堿性磷酸酶染色鑒定。

1．2.6腺病毒介導的VEGF轉染選擇生長(cháng)良好的傳代細胞，待其生長(cháng)70%匯合時(shí)，用AdVEGF165轉染（感染倍數為50∶1），設置對照組（只加DMEM）。2組終末體積用含10%新生牛血清DMEM調5ml，24h后，換液加入含10%新生牛血清DMEM10ml中，于37℃、5%的CO2條件下培養。分別于第1、3、5、7、9、11、13和15d收獲上清,離心后-70℃保存。上清標本統一用VEGFELISA試劑盒檢測VEGF濃度。

1．2.7復合物培育將環(huán)氧乙烷消毒備用的大小為30mm×5mm×5mm的珊瑚羥基磷灰石仿生人工骨分別放置于6個(gè)培養皿中，每皿分別加入濃度為2×106個(gè)/ml的已轉染成功的MSCs，然后放入5％的CO2、37℃孵箱中培養，每天觀(guān)察細胞在材料上及周邊的生長(cháng)情況，并照相記錄。隔天換液，培養3d，備用。

1．2.8手術(shù)方法全身麻醉取俯臥位，備皮，采用2%碘伏消毒術(shù)區，沿雙側腰背筋膜縱向切開(kāi)，分離長(cháng)肌和多裂肌，顯露雙側L5、6棘突，去除部分皮質(zhì)骨后*止血，然后按照分組的不同于雙側橫突間各自植入基因增強人工骨骨條和自體骨條，肌肉覆蓋固定，后逐層縫合切口并包扎。于術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后各用青霉素20×104U肌注，植入后1～3d每日20×104U青霉素肌注，植入后分欄飼養，不限活動(dòng)。

1．2.9手法觸診檢查植入物硬度，輕柔檢測L5、6活動(dòng)度，無(wú)活動(dòng)判定為融合，有活動(dòng)判定為不融合。

1．2.10影像學(xué)檢測術(shù)后4、8、12周每只山羊拍攝前后位X線(xiàn)片，觀(guān)察植骨處骨小梁長(cháng)入情況。有連續骨小梁長(cháng)入的判定為融合，其他情況為不融合。

1．2.11組織學(xué)檢測12周后將動(dòng)物處死，取出植入物，福爾馬林固定24h，環(huán)鋸水平修整后脫水，甲基丙烯酸輕乙基酯（GMA）和甲基丙烯酸丁酯（BMA）混合液浸透后包埋、切片，厚度為5μm。切片行HE染色，觀(guān)察。

1．2.12生物力學(xué)檢測處死動(dòng)物后取受力方向的骨塊，大小為4mm×4mm×3mm，用材料試驗機測試，加載速度為2mm/min。采用點(diǎn)壓技術(shù)和直徑2mm的圓柱形壓頭，計算壓穿軟骨下骨板時(shí)的壓縮強度（從開(kāi)始加載的基點(diǎn)斷裂點(diǎn)峰值之間的壓力與壓頭面積的比值），在應力應變曲線(xiàn)上計量其彈性模量。

1．3統計學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統計學(xué)處理，定量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間差異采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學(xué)意義。

2結果

2．1細胞鑒定結果

剛接種的細胞為球形懸浮在胞液之中，混有少量的血細胞，4~5d后換細胞液，可見(jiàn)大量單核細胞呈圓形，未*貼壁；8~10d后換細胞液，可見(jiàn)單核細胞*貼壁，變成梭形及多角形，12d后大量單核細胞連接成片，形成纖維樣細胞集落，15~20d后細胞逐漸匯集，多呈長(cháng)梭形及多角形，流式細胞儀檢測CD90和CD54為陽(yáng)性，CD34和CD14為陰性，符合骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原特征。

2．2成骨細胞誘導鑒定

12～14d基質(zhì)礦鹽形成鈣化結節，堿性磷酸酶染色可見(jiàn)胞漿被染成棕黑色，并有黑色顆粒沉積，說(shuō)明培養形成的細胞具有成骨細胞的特性，具有體外成骨的能力（此種細胞含量超過(guò)80%）。

2．3VEGF轉染結果

結果顯示轉染組細胞培養上清液中VEGF分泌顯著(zhù)高于未轉染組（P<0.01），分泌高峰在7～9d，此后逐漸下降，15d仍然可檢測到，且依然高于對照組。

2．4手法觸診

所有實(shí)驗動(dòng)物均存活且未見(jiàn)異常反應，4周后均有活動(dòng)度，8周后CHA-MSCs-VEGF組無(wú)活動(dòng)度，12周后2組均無(wú)活動(dòng)度。

2．5影像學(xué)檢測

4周后均未見(jiàn)骨小梁，8周后開(kāi)始2組均可見(jiàn)骨小梁。

2．6組織學(xué)檢測

CHA-MSCs-VEGF組術(shù)后12周有少量軟骨及大量的連續骨小梁形成，可見(jiàn)皮質(zhì)骨圍繞，可見(jiàn)軟骨結構形成，之后成骨，成骨代謝活性已非常接近正常，植入材料與骨組織達到骨性融合，自體髂骨組術(shù)后12周可見(jiàn)新生骨組織形成，但其成骨能力不及CHA-MSCs-VEGF組。

2．7生物力學(xué)檢測

CHA-MSCs-VEGF組與自體組在大壓縮強度和彈性模量2方面差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。

3討論

MSCs是近幾年來(lái)研究熱門(mén)的干細胞，具有在一定的培養條件下，可以分化為骨細胞，維持一定時(shí)期內細胞的生長(cháng)形態(tài)穩定、增殖速度較快、細胞的生存適應能力較強、貼壁時(shí)間短、成活率高等優(yōu)點(diǎn)，是目前骨組織工程中較為理想的種子細胞。本實(shí)驗采用Percoll梯度離心法，成功分離MSCs，并誘導其向成骨細胞分化。支架物質(zhì)CHA是以特定的天然優(yōu)質(zhì)珊瑚為原料，經(jīng)過(guò)一系列復雜的熱液置換反應，將珊瑚中的礦物質(zhì)轉換為羥基磷灰石并保留了珊瑚天然的孔隙，得到物理結構和無(wú)機成分與人體骨相似的產(chǎn)物，其不僅具有一定的機械強度和骨誘導物質(zhì)融合面積，而且其植入機體組織后有良好的生物相容性，不產(chǎn)生局部或全身性毒性反應，無(wú)炎癥排斥反應，具有良好的成骨潛能。為了促進(jìn)上述人工骨能更好地與機體組織融合，本研究還加入了血管內皮生長(cháng)因子（VEGF），其為機體內促進(jìn)血管生長(cháng)的重要的生長(cháng)因子，在體內外均可以特異性促進(jìn)血管內皮細胞的生長(cháng)并誘導血管生成。*，臨床骨折的愈合快慢與病損處血供有著(zhù)密切的關(guān)系，將VEFG基因轉染入人工骨的構建之中，可促進(jìn)骨組織血管的形成、加速骨質(zhì)間的融合和生長(cháng)。本實(shí)驗中，由觸診和影像學(xué)檢測發(fā)現，該基因增強人工骨在融合速度上快于自體髂骨，從組織切片上可看出，其成骨的質(zhì)量上比自體髂骨更加成熟，在生物力學(xué)的檢測中，該人工骨在大壓縮強度和彈性模量上均接近正常骨組織。綜上所述，CHA-MSCs-VEGF三聯(lián)人工骨復合物具有取材方便、培養簡(jiǎn)單、相容性好、成骨迅速、生物力學(xué)強度高等優(yōu)點(diǎn)，有望廣泛應用于臨床植骨融合手術(shù)中骨骼的替代材料。